A. Introducción

Staphylococcus aureus es una especie bacteriana integrada por formas cocáceas de 0,8-1,0 mm de diámetro, que se dividen en más de un plano, por lo que se agrupan irregularmente en racimos. Son inmóviles y no forman esporas. Son grampositivas. Es una especie muy sensible a la acción del calor y de los desinfectantes.

Más del 50 % de las personas son portadoras de S.aureus en fosas nasales, garganta, forúnculos, manos o pelo. Por eso su presencia en determinados niveles en los alimentos es un signo evidente de falta de higiene en la manipulación.

Además algunas cepas de S.aureus son patógenas para el hombre porque producen enterotoxinas que dan lugar a la intoxicación estafilocócica. La dosis infectiva es alta ya que es necesario un número de al menos 10⁶ ufc/g para producir cantidad suficiente de enterotoxina para producir la enfermedad en el consumidor.

En resumen, la presencia de un número elevado de Staphylococcus aureus en un alimento refleja higiene defectuosa por mala manipulación. Si, además, los S. aureus aislados son cepas enterotoxigénicas, suponen un riesgo para la salud.

Puede ocurrir que no se detecte S. aureus en un alimento, que el número detectado sea pequeño y que, sin embargo, exista cantidad detectable suficiente de enterotoxina estafilocócica. En este caso, los microorganismos que originaron la toxina han ido descendiendo en número e, incluso, desapareciendo, mientras que la toxina, por su mayor resistencia, permanece en el alimento.

El método de recuento en placa se utiliza cuando se sospecha que el alimento por analizar contiene más de 100 S. aureus por gramo.

B. Material

• Pipetas de 1 estériles
• Estufa de cultivo
• Asa de vidrio estéril
• Asa de cultivo
• Placas de Petri de 90 mm de diámetro

C. Medios de cultivo y reactivos

- Medio sólido selectivo Baird Parker (B P) Ver composición y preparación

- Caldo cerebro corazón (Brain Heart Infusión: BHI) Ver composición y preparación

- Plasma de conejo con ácido Etilen diamino tetraacético (EDTA)

Plasma de conejo, desecado y titulado, que evita reacciones falsas en la prueba de la coagulasa. Este producto se adquiere en casas comerciales.

D. Preparación de la muestra (Ver videoclip de preparación de muestra -requiere QuickTime-)(Esta película es más larga, en esta demo sólo podrá ver 20 segundos)

Preparación de la muestra
	Pesar en condiciones asépticas 10 gramos de muestra.
	Añadir 90 ml de agua de triptona al 0,1%.
	Homogenizar la mezcla en el Stomacher durante 1 a 4 minutos, el tiempo varía según el tipo de alimento. (Si no se dispone de stomacher puede homogenizarse en una trituradora de cuchillas -tipo batidora- a  una velocidad aproximada de 14.000 rpm y en un tiempo medio de 60-90 segundos) Revivificación; dejar reposar 1 hora a 20ºC.

E. Preparación de las diluciones decimales

Preparación diluciones decimales
	A partir de esta, se preparan diluciones decimales sucesivas, tomando 1 mL de la primera dilución y descargándolo en un tubo que contenga 9 mL de diluyente (agua de triptona al 0,1%) y así sucesivamente con las siguientes diluciones.
	Mezclar manualmente cada dilución agitándola 25 veces en 7 segundos con movimientos ascendentes y descendentes formando un ángulo de abertura aproximado de 60º entre brazo y antebrazo. O mezclar mecánicamente utilizando un agitador Vortex.
	De esta forma obtenemos las diluciones 10-2, 10-3, 10-4, etc (es decir 1/100, 1/1000, 1/10000, etc.) Por tanto, los números 100, 1000 y 10000, etc. son los factores de dilución “D”.

F. Siembra por extensión en superficie  (Ver vídeoclip de la siembra -requiere QuickTime-)(Esta película es más larga, en esta demo sólo podrá ver 20 segundos)

Siembra placas de agar Baird Parker
	En esta etapa, se utiliza un medio de cultivo selectivo Baird Parker en que las colonias de Staphylococcus aureus crecen con un aspecto característico.
	Partiendo de las diluciones decimales, sembrar, por diplicado, en placas Baird Parker, mediante extensión en superficie.

G. Incubación de las placas (Ver vídeoclip de incubación -requiere QuickTime-)(Esta película es más larga, en esta demo sólo podrá ver 20 segundos)

Incubar a 37ºC durante 48 ± 2 horas. Después de la incubación, examinar las placas para ver la presencia de colonias sospechosas de S. aureus

H. Lectura de las placas y recuentos de colonias (Ver vídeoclip del recuento -requiere QuickTime-)(Esta película es más larga, en esta demo sólo podrá ver 20 segundos)

El aspecto de las colonias típicas de Staphylococcus aureus sobre agar Baird-Parker es el siguiente: redondas, de bordes lisos, convexas, de 2-3 mm de diámetro, húmedas, brillantes, negras, con un borde blanco fino, rodeadas de una zona opaca y de un halo claro de 2-5 mm. El cloruro de litio y el telurito potásico que forman parte del medio inhiben el desarrollo de la flora competitiva; el piruvato sódico y la glicocola favorecen el crecimiento de los estafilococos.
El medio de cultivo es opaco, debido a que se le incorpora emulsión de yema de huevo. S. aureus sintetiza una lipasa que, al actuar sobre la lipoproteina de la yema de huevo, produce un aclaramiento alrededor de las colonias. Alrededor de las colonias se forma también una zona opaca como consecuencia de la formación de un precipitado de sales de calcio y magnesio, insoluble en ácidos grasos. Esta zona opaca se hace más visible a partir de las 24 horas de incubación. El aclaramiento del medio que rodea a las colonias junto con el color negro brillante de las mismas, son las caracteristicas típicas mas visibles de las colonias típicas. Las colonias que no presentan ese color negro brillante o que no tienen alrededor un halo claro de lipolisis son consideradas atípicas y desechadas.	Colonias típicas Colonias atípicas
Recuento de colonias sospechosas. Seleccionar para el recuento aquellas placas que contengan entre 20 y 200 colonias típicas. Una vez contadas estas colonias en las placas elegidas se deben hacer pruebas confirmativas, en particular la prueba de la coagulasa. Si las colonias contadas son coagulasa positivas entonces expresaremos el recuento como ufc/g de S.aureus coagulasa positivo. Para ello la cifra obtenida en las placas se multiplica por el factor de dilución de la placa, lo que da como resultado el recuento total de S. aureus coagulasa positivo en 0,1 gramo del producto analizado. Esta cifra, multiplicada por 10, expresa el recuento total de S. aureus por gramo o mililitro de muestra.

I. Cálculos y expresión de los resultados

Cálculos: En las placas que se ha efectuado el recuento, multiplicar por el inverso de la dilución y expresar el resultado como Unidades Formadoras de Colonias por g de alimento (UFC/g).	N = C x D x 10 donde:  N= Unidades formadoras de colonia por gramo de muestra (UFC/g o UFC/mL).    C= Media del número de colonias en las dos placas.    D= Factor o inverso de la dilución.
Expresión de los resultados: Media del número de colonias típicas en las dos placas x inverso de la dilución x 10 = UFC/g o UFC/mL

J. Confirmación con la prueba de la coagulasa (Ver vídeoclip de la prueba de la Coagulasa -requiere QuickTime-)(Esta película es más larga, en esta demo sólo podrá ver 20 segundos)

Se seleccionan, como minino, dos colonias típicas para su confirmación. Con este fin, se investiga la capacidad de la cepa en estudio para producir Coagulasa. La coagulasa es un enzima capaz de desnaturalizar la fibrina del plasma. La mayoría de las cepas de Staphylococcus aureus patógenas (enterotoxigénicas) producen esta enzima. Las colonias típicas seleccionadas se siembran en caldo infusión cerebro-corazón, BHI (Brain Heart Infusion) contenido en tubos. Incubar a 37 ºC durante 18-24 horas.
Prueba de la coagulasa: En un tubo de 10 x 75 mm estéril, se vierten 0,3 mL de plasma de conejo EDTA reconstituido. Se añade 0,1 mL del cultivo obtenido en caldo BHI. Mezclar suavemente
Incubar a 37ºC durante 6 horas Incubar a 37 ºC y examinar a las 6 horas de incubación.
Coagulasa positiva La reacción es positiva cuando el coágulo formado es firme.
Coagulasa negativa La reacción es negativa cuando no se cuagula el plasma.

K. Entrenamiento en la distinción y recuento de colonias de Staphylococcus aureus

Analice cada placa, y conteste a la pregunta, en la columna de la derecha, haciendo clic sobre la letra (en azul), que precede a la contestación u opción que crea correcta
	Estas colonias en el medio de Baird Parker presentan : a ) características típicas de S. aureus b ) características atípicas de S. aureus
	Estas colonias en el medio de Baird Parker presentan : a ) características típicas de S. aureus b ) características atípicas de S. aureus
	Estas colonias en el medio de Baird Parker presentan : a ) características típicas de S. aureus b ) características atípicas de S. aureus
	Estas colonias en el medio de Baird Parker presentan : a ) características típicas de S. aureus b ) características atípicas de S. aureus
	Estas colonias en el medio de Baird Parker presentan : a ) características típicas de S. aureus b ) características atípicas de S. aureus
	En esta placa de Baird Parker : a ) aparecen colonias típicas de S. aureus b ) no aparecen colonias típicas de S. aureus
	En esta placa de Baird Parker : a ) aparecen colonias típicas de S. aureus b ) no aparecen colonias típicas de S. aureus
	En esta placa de Baird Parker : a ) aparecen colonias típicas de S. aureus b ) no aparecen colonias típicas de S. aureus
	En esta placa de Baird Parker : a ) aparecen colonias típicas de S. aureus b ) no aparecen colonias típicas de S. aureus

L. Interpretación de los resultados del supuesto práctico

Los resultados obtenidos en los duplicados de este supuesto práctico han sido los siguientes
Placas de Baird Parker(Haga clic sobre la placa para verla a más aumento)
	Duplicado A	Duplicado B
10-1
10-2
10-3
Prueba de la coagulasa
Colonia #1
Colonia #2

LL.- Contestación a las preguntas

Una vez interpretado los resultados conteste a las siguientes preguntas haciendo clic en los radiobotones de la opción correcta

1.- Han dado valores superiores a 200 colonias por placa las diluciones:

a) 10^-1
b) 10^-1 y 10^-2
c) 10^-1 , 10^-2 y 10^-3

2.-Para realizar el recuento he escogido las placas de la dilución:

a) 10^-1
b) 10^-2
c) 10^-3

3.- El factor de dilución (D) de las placas que he escogido para realizar el recuento es de:

a) 10
b) 100
c) 1000

4.-El número de colonias que han crecido en la placa A de la dilución 10^-3 ha sido aproximadamente de :

a) 25
b) 35
c) 45

5.- La confirmación con la prueba de la coagulasa ha dado el resultado siguiente :

a) las 2 colonias confirmadas como coagulasa positiva
b) las 2 colonias como coagulasa negativas y por lo tanto no confirmadas como S. aureus
c) una colonia coagulasa positiva y la otra colonia coagulasa negativa

6.- El número de unidades formadoras de colonia por gramo de muestra ha sido de:

a) 3300 (3,3 x 10³) UFC de S. aureus por gramo de muestra
b) 33000 (3,3 x 10⁴) UFC de S. aureus por gramo de muestra
c)330000 (3,3 x 10⁵) UFC de S. aureus por gramo de muestra

I.- Envío al servidor de los resultados del ejercicio

En este apartado le pedimos que haga un resumen del ejercicio, en lo que se refiere al método o análisis descrito y nos dé su opinión sobre el mismo (nivel de dificultad que le ha parecido que presenta la realización y la interpretación, así como el grado de utilidad).

NOTA IMPORTANTE: Las dudas que hayan surgido durante la realización del ejercicio no las incluya en este apartado; diríjase a nosotros a través del correo electrónico:tutormicroali@universitas.usal.es

Introduzca sus datos en las casillas y posteriormente pulse sobre el botón 'ENVIAR'. Espere unos segundos hasta que el servidor conteste con los aciertos y fallos.