AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN
DE SHIGELLA


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Apartados de este ejercicio

A. Características generales de Shigella

B. Material
C. Medios de cultivo y reactivos
D. Fases del aislamiento e identificación de Shigella
E. Fase 1.-Filtración de Membrana y Preenriquecimiento en medio líquido líquido
F. Fase 2.-Aislamiento diferencial en medios sólidos selectivos
G. Fase 3.-Identificación Bioquímica
H. Expresión de los resultados
I. Resumen
J. Introducción del comentario
K.- Envío al servidor de los resultados del ejercicio


A. Características generales de Shigella.

Shigella es un género bacteriano perteneciente a la familia Enterobacteriaceae, integrado por bacterias de forma bacilar, no esporuladas, inmóviles, pero animados de movimiento pendular (oscilación) in situ.

Son gram negativos, aerobios-anaerobios facultativos. Citocromo-oxidasa negativos. Fermentan la glucosa sin producción de gas; no obstante, se han encontrado algunos biotipos que producen gas de la glucosa. No descarboxilan la lisina. No fermentan la lactosa. No utilizan el citrato como única fuente de carbono. No crecen en el medio cianuro potásico. Su actividad bioquímica es muy reducida.

El género Shigella se divide en cuatro especies: S. dysenteriae, S. flexneri, S. boydii, S. sonnei.


B. Material


C. Medios de cultivo y reactivos


D. Fases del aislamiento e identificación de Shigella

    1. Filtración de Membrana y Preenriquecimiento en medio líquido.

    2. Aislamiento diferencial sobre medios sólidos selectivos.

    3. Confirmación bioquímica de las colonias sospechosas.

E. Fase 1.-Filtración de Membrana y Preenriquecimiento en medio líquido líquido (Ver vídeo de Filtración y Preenriquecimiento)

Se utiliza la filtración de membrana para concentrar las bacterias existentes en 100 mL de agua.
En condiciones asépticas, se utiliza un filtro de membrana de 0,45 µm de tamaño de poro que se coloca en el portafiltros de la rampa de filtración de vacío.

filtración de membrana

Se coloca el embudo del filtro previamente esterilizado.

filtración de membrana

Se inicia la filtración de los 100 mL de agua.

filtracion de membrana

Una vez finalizado, se recoge el filtro con unas pinzas estériles y se coloca dentro de un matraz con Caldo de Cultivo pH 8.

Se incuba el matraz a 37ºC durante 1-5 días.


F. Fase 2.-Aislamiento diferencial en medios sólidos selectivos (Ver vídeo Aislamiento Diferencial)

En esta etapa se utilizan medios de cultivo diferenciales que por su composición permiten que las colonias de Shigella crezcan con un aspecto característico en cada uno de ellos (colonias típicas)

A partir del cultivo obtenido en el preenriquecimiento sembrar, por duplicado, con asa de cultivo sobre:

Agar Salmonella-Shigella (S-S)

Agar Salmonella-Shigella

Agar Xilosa-Lisina-Desoxicolato (Xylose Lysine Desoxycholate: XLD)

Agar Xilosa

Agar MacConkey

MacConkey

AGAR SALMONELLA-SHIGELLA (S-S): CRECIMIENTO CARACTERÍSTICO (Hacer clic sobre cada placa para aumentar)
Las colonias sospechosas de Shigella crecidas en Agar Salmonella-Shigella son transparentes, translúcidas u opacas y suelen ser lisas. En este medio las colonias de otros microorganismos que fermentan la lactosa (coliformes) son colonias rojizas y en muchos casos mucoides.

Shigella

COLONIAS SOSPECHOSAS

AGAR XILOSA-LISINA-DESOXICOLATO (XLD): CRECIMIENTO CARACTERÍSTICO (Hacer clic sobre cada placa para aumentar)
Las colonias sospechosas de Shigella crecidas sobre Agar Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD) son transparentes y del mismo color que el medio de cultivo (rojo).

Este género bacteriano al no fermentar la xilosa, la lactosa ni la sacarosa, no da lugar a que vire a amarillo el rojo fenol. Como tampoco descarboxilan la lisina, no se produce color rojo púrpura alrededor de las colonias, al no haberse producido cadaverina.

Shigella Shigella

COLONIAS SOSPECHOSAS

AGAR MAC CONKEY: CRECIMIENTO CARACTERÍSTICO (Hacer clic sobre cada placa para aumentar)



Las colonias sospechosas de Shigella en Agar MacConkey son incoloras y transparentes. En este medio las colonias de otros microorganismos que fermentan la lactosa (coliformes) son colonias rojizas.

Shigella Shigella

COLONIAS SOSPECHOSAS

Le aconsejamos que se ejercite en la interpretación de las imágenes comprobando su correcta interpretación haciendo clic en cada pregunta en la letra azul que antecede a la opción que le parezca correcta.

Debe seleccionar las placas de los distintos medios selectivos en las que observe un crecimiento típico de Shigella.

Ejemplo 1

Ejemplo 2

Ejemplo 3

Agar S-S
Agar S-S

(Hacer clic sobre cada placa para aumentar)


Agar XLD
Agar XLD

(Hacer clic sobre cada placa para aumentar)


Agar MacConkey
Agar MacConkey

(Hacer clic sobre cada placa para aumentar)

En este caso:
a) Placa seleccionada
b) Placa no seleccionada
En este caso:
a) Placa seleccionada
b) Placa no seleccionada
En este caso:
a) Placa seleccionada
b) Placa no seleccionada

Ejemplo 4

Ejemplo 5

Ejemplo 6


Agar XLD

(Hacer clic sobre cada placa para aumentar)


Agar MacConkey

(Hacer clic sobre cada placa para aumentar)


Agar XLD

(Hacer clic sobre cada placa para aumentar)

En este caso:
a) Placa seleccionada
b) Placa no seleccionada
En este caso:
a) Placa seleccionada
b) Placa no seleccionada
En este caso:
a) Placa seleccionada
b) Placa no seleccionada

Lectura de resultados sobre agar Salmonella-Shigella del supuesto práctico

Se trata de interpretar los resultados obtenidos en las siembras sobre agares selectivos en busca de colonias sospechosas de Shigella. Para ello:

1º. Observe las placas buscando colonias sospechosas de Shigella
1º. Observe también las placas buscando colonias no sospechosas de Shigella
2º. Conteste a las preguntas

AGAR SALMONELLA-SHIGELLA (S-S)
(Hacer clic sobre cada placa para aumentar)

AGAR SALMONELLA-SHIGELLA
Placa S-S1

AGAR SALMONELLA-SHIGELLA
Placa S-S2

AGAR SALMONELLA-SHIGELLA
Placa S-S3

AGAR SALMONELLA-SHIGELLA
Placa S-S4

Contestación a las preguntas

1. Se han encontrado colonias sospechosas de Shigella en las placas de "agar Salmonella-Shigella":

a) S-S4
b) S-S3, S-S2
c) S-S1, S-S2

2. No se han encontrado colonias sospechosas de Shigella en las placas de Salmonella-Shigella:

a) S-S1, S-S4
b) S-S1, S-S2, S-S3
c) S-S3

AGAR XILOSA-LISINA-DESOXICOLATO (XLD)
(Hacer clic sobre cada placa para aumentar)

AGAR XILOSA-LISINA-DESOXICOLATO
Placa XLD1

AGAR XILOSA-LISINA-DESOXICOLATO
Placa XLD2

XLD
Placa XLD3

agar XLD
Placa XLD4

Contestación a las preguntas

3. Se han encontrado colonias sospechosas de Shigella en las placas de Xilosa-Lisina-Desoxicolato:

a) XLD4, XLD3
b) XLD1, XLD2
c) XLD1

4. No se han encontrado colonias sospechosas de Shigella en las placas de Xilosa-Lisina-Desoxicolato:

a) XLD1
b) XLD2, XLD3, XLD4
c) XLD4, XLD3

AGAR MAC CONKEY
(Hacer clic sobre cada placa para aumentar)

AGAR MAC CONKEY
Placa Mac1

AGAR MAC CONKEY
Placa Mac2

AGAR MAC CONKEY
Placa Mac3

AGAR MAC CONKEY
Placa Mac4

Contestación a las preguntas

5. Se han encontrado colonias sospechosas de Shigella en las placas de MacConkey:

a) Mac2, Mac3, Mac4
b) Mac2
c) Mac2, Mac4

6. No se han encontrado colonias sospechosas de Shigella en las placas de MacConkey:

a) Mac1
b) Mac4, Mac2
c) Mac4, Mac3, Mac1


G. Fase 3.-Identificación Bioquímica

Esta identificación se suele realizar en 2 subfases:

Subfase 4A: Identificación bioquímica inicial con unas pruebas determinadas: Generalmente, fermentación de glucosa y lactosa (TSI), descarboxilación de la lisina (LIA) y utilización de la urea.

Subfase 4B: Identificación bioquímica final con un sistema multipruebas: Generalmente con las 20 pruebas de la galería API20E. Esta subfase sólo se realiza con las cepas seleccionadas en la subfase anterior.

Subfase 4A. Identificación bioquímica inicial (Ver vídeo Identificación Bioquímica Inicial)

Aislar, como mínimo, dos colonias con aspecto típico de Shigella de cada uno de los medios de aislamiento selectivo utilizados.
Sembrar cada colonia en Agar Hierro Triple Azúcar (TSI), con aguja de cultivo, primero en el fondo por picadura y luego, en la superficie inclinada por estría.

TSI

Sembrar, por picadura en el fondo y por estría en la superficie inclinada del medio Agar Lisina Hierro (LIA).

LIA

Sembrar, con asa de siembra en Caldo Urea.

Caldo Urea

Incubar los tubos de TSI y Urea a 37 ºC durante 24 horas y los de agar LIA a 37 ºC durante 24-48 horas.

REACCIONES POSITIVAS DE LAS PRUEBAS BIOQUÍMICAS:

AGAR TRIPLE-AZUCAR-HIERRO
Shigella da la siguiente reacción sobre TSI:

- Alcalina (rojo) en la superficie inclinada.

- Ácida (amarillo) en el fondo.

- Sin producción de SH2 (sin ennegrecimiento del fondo del tubo).

AGAR TRIPLE-AZUCAR-HIERRO
AGAR TRIPLE-AZUCAR-HIERRO
Lactosa (-), Glucosa (+), SH2 (-) con o sin gas

AGAR LISINA-HIERRO
Shigella da la siguiente reacción sobre LIA:

- Alcalina (color púrpura) en la superficie inclinada.

- Ácida (amarillo) en el fondo.

- Sin Producción de SH2 (ennegrecimiento del fondo del tubo).

AGAR LISINA-HIERRO
AGAR LISINA-HIERRO
LCD (-), SH2 (-)

CALDO UREA
Las Shigella no son capaces de utilizar urea.


El medio urea contiene un indicador de pH que vira a color rosa fuerte cuando la reacción es positiva.

La reacción debe ser negativa: urea (-).
Permanece el mismo color que antes de la incubación

CALDO UREA

REACCIÓN NEGATIVA



CALDO UREA

REACCIÓN POSITIVA

Seleccionar todos los cultivos que muestren crecimiento característico de Shigella sobre agar TSI, se correspondan o no con la reacción de dichos cultivos en agar LlA.

No desechar los cultivos atípicos sobre agar TSI cuando la reacción sobre agar LIA es típica.

Desechar los cultivos que no se correspondan con el crecimiento típico de las Shigella sobre agar TSI ni con el de agar LIA.

 

Caso 1

Caso 2

Caso 3

Caso 4

TSI

Típico

Típico

Atípico

Atípico

LIA

Típico

Atípico

Típico

Atípico

 

Seleccionar

Seleccionar

Seleccionar

Desechar

Desechar todos los cultivos que den urea positivos

 

TSI

LIA

Urea

Caso 1

Típico

Típico

Negativo

Seleccionar

Caso 2

Típico

Típico

Positivo

Desechar

Caso 3

Típico

Atípico

Negativo

Seleccionar

Caso 4

Típico

Atípico

Positivo

Desechar

Caso 5

Atípico

Típico

Negativo

Seleccionar

Caso 6

Atípico

Típico

Positivo

Desechar

Caso 7

Atípico

Atípico

Negativo

Desechar

Caso 8

Atípico

Atípico

Positivo

Desechar



Le aconsejamos que se ejercite en la interpretación de las imágenes comprobando su correcta interpretación haciendo clic en cada pregunta en la letra azul que antecede a la opción que le parezca correcta.

Debe seleccionar los tubos de las distintas pruebas bioquímicas en las que observe una reacción típica de Shigella.

Ejemplo 1

Ejemplo 2

Ejemplo 3

Ejemplo 4

Agar TSI
Agar TSI


Agar TSI
Agar TSI


Agar TSI
Agar TSI

Agar TSI
Agar TSI

En este caso:
a) Tubo seleccionado
b) Tubo no seleccionado
En este caso:
a) Tubo seleccionado
b) Tubo no seleccionado
En este caso:
a) Tubo seleccionado
b) Tubo no seleccionado
En este caso:
a) Tubo seleccionado
b) Tubo no seleccionado

Ejemplo 4

Ejemplo 5

Ejemplo 6

 

Agar LIA
Agar LIA

Agar LIA
Agar LIA

Agar LIA
Agar LIA

Agar LIA
Agar LIA

En este caso:
a) Tubo seleccionado
b) Tubo no seleccionado
En este caso:
a) Tubo seleccionado
b) Tubo no seleccionado
En este caso:
a) Tubo seleccionado
b) Tubo no seleccionado
En este caso:
a) Tubo seleccionado
b) Tubo no seleccionado

Lectura de resultados de la confirmación bioquímica inicial del supuesto práctico

Colonias

TSI

LIA

Urea

Contestación
Preguntas

Colonia 1

7. Esta colonia debe ser:

Seleccionada
Desechada

Colonia 2


8. Esta colonia debe ser:

Seleccionada
Desechada

Colonia 3

9. Esta colonia debe ser:

Seleccionada
Desechada

Colonia 4

10. Esta colonia debe ser:

Seleccionada
Desechada

Colonia 5

11. Esta colonia debe ser:

Seleccionada
Desechada

Colonia 6

12. Esta colonia debe ser:

Seleccionada
Desechada

Colonia 7

13. Esta colonia debe ser:

Seleccionada
Desechada

Subfase 4B. Identificación bioquímica final (Ver vídeo galería API)

Con las colonias seleccionadas en la identificación bioquímica inicial se efectúa lo siguiente:
A partir de los tubos positivos de TSI o LIA, sembrar una galería de identificación bioquímica partiendo de los cultivos seleccionados.

Identificación bioquímica

Habitualmente se hace una galería API 20E que consiste en 20 pruebas bioquímicas y que permite identificar el microorganismo al menos a nivel de Género y en muchos casos también a nivel de Especie.

Identificación bioquímica


Lectura de resultados de la confirmación bioquímica final del supuesto práctico

Cepas

API20E
Ayuda Interpretación Resultados

Contestación preguntas

Seleccionada 1

API20E
Ver perfiles numéricos

14. La codificación corresponde a:

0104140 Shigella flexneri
0104521 Yersinia enterocolitica
2504752 Salmonella spp.
3005573 Enterobacter cloacae
0776000 Proteus mirabilis.
5044124 Vibrio cholerae
5306761 Serratia marcescens
6504750 Salmonella spp.
7704752 Salmonella spp.
1104112 Shigella sonnei

Seleccionada 2

API20E
Ver perfiles numéricos

15. La codificación corresponde a:

0104452 Salmonella paratyphi A
1104112 Shigella sonnei
4104100 Salmonella gallinarum
4504010 Salmonella pullorum
5100100 Yersinia ruckeri
0676001 Proteus vulgaris
5306761 Serratia marcescens
5704552 Salmonella arizonae
6004540 Salmonella typhi
0104140 Shigella flexneri

Seleccionada 3

API20E
Ver perfiles numéricos

16. La codificación corresponde a:

5044560 Escherichia coli
1104112 Shigella sonnei
7004743 Klebsiella ozaenae
0206042 Acinetobacter calcoaceticus
0104452 Salmonella paratyphi A
0774000 Proteus mirabilis
0676001 Proteus vulgaris
0104140 Shigella flexneri
5204024 Pseudomonas cepacea
6704752 Salmonella sp

Seleccionada 4

API20E
Ver perfiles numéricos

17. La codificación corresponde a:

5044560 Escherichia coli
0104140 Shigella flexneri
7004743 Klebsiella ozaenae
0104452 Salmonella paratyphi A
1104112 Shigella sonnei
0774000 Proteus mirabilis
0676001 Proteus vulgaris
5346761 Serratia marcescens
5204024 Pseudomonas cepacea
6704532 Salmonella sp


H. Expresión de los resultados

Expresión final de los resultados de la investigación de Salmonelas en la muestra

Criterios

Contestación a las preguntas

Si la confirmación bioquímica ha resultado positiva para alguna de las cepas :

Expresar los resultados como
Presencia de Shigella en 100 mL de agua

En casi contrario, expresar los resultados como:

Ausencia de Shigella en 100 mL de agua

18. El aislamiento e investigación de Shigella en la muestra del supuesto práctico ha dado como resultado:

a) Presencia de Shigella en 100 mL de agua

b) Ausencia de Shigella en 100 mL de agua


I. Resumen

1º Filtración de Membrana y Preenriquecimiento en medio líquido 100 mL de agua + 100 mL de Caldo de Cultivo pH 8

Incubar 37ºC/1-5 días
2º Aislamiento diferencial sobre medios sólidos selectivos. - Agar Salmonella-Shigella (S-S)

- Agar Xilosa-Lisina-Desoxicolato (Xylose Lysine Desoxycholate: XLD)

- Agar MacConkey

Seleccionar colonias típicas
3º Confirmación Bioquímica - Agar TSI. Incubar 37ºC/24 horas

- Agar LIA. Incubar 37ºC/24 horas

- Citrato de Urea

Si dan resultados típicos de Shigella, realizar Galería API 20E.
4º Expresión de los resultados Expresar los resultados como:

Presencia de Shigella en 100 mL de agua

Ausencia de Shigella en 100 mL de agua



J. Introducción del comentario

En este apartado le pedimos que haga un resumen del ejercicio, en lo que se refiere al método o análisis descrito y nos dé su opinión sobre el mismo (nivel de dificultad que le ha parecido que presenta la realización y la interpretación, así como el grado de utilidad).

NOTA IMPORTANTE: Las dudas que hayan surgido durante la realización del ejercicio no las incluya en este apartado; diríjase a nosotros a través del correo electrónico:tutoraguas@universitas.usal.es


K. Envío de las contestaciones al servidor

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Laboratorio de Tecnología Educativa. Departamento de Microbiología y Genética. Universidad de Salamanca.