Los coliformes totales
son las Enterobacteriaceae lactosa-positivas y constituyen un grupo de bacterias
que se definen más por las pruebas usadas para su aislamiento que por criterios
taxonómicos. Pertenecen a la familia Enterobacteriaceae y se caracterizan
por su capacidad para fermentar la lactosa con producción de ácido
y gas, más o menos rápidamente, en un periodo de 48 horas y con una
temperatura de incubación comprendida entre 30-37ºC.
Son bacilos gramnegativos, aerobios y anaerobios facultativos, no esporulados. Del
grupo <<coliforme>> forman parte varios géneros: Escherichia,
Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, etc. Se encuentran en el intestino
del hombre y de los animales, pero también en otros ambientes: agua, suelo,
plantas, cáscara de huevo, etc.
Una elevada proporción
de los coliformes que existen el los sistemas de distribución no se debe a
un fallo en el tratamiento en la planta, sino a un recrecimiento de las bacterias
en las conducciones. Dado que es dificil distinguir entre recrecimiento de coliformes
y nuevas contaminaciones, se admite que todas las apariciones de coliformes son nuevas
contaminaciones, mientras no se demuestre lo contrario.
Dentro del grupo de los coliformes totales existe un subgrupo que es el de los Coliformes
fecales. Los coliformes fecales son coliformes totales que además fermentan
la lactosa con producción de ácido y gas en 24-48 horas a temperaturas
comprendidas entre 44 y 45ºC en presencia de sales biliares. Los coliformes
fecales comprenden principalmente Escherichia coli y algunas cepas de Enterobacter
y Klebsiella.
Su origen es principalmente fecal y por esos se consideran índices de
contaminación fecal. Pero el verdadero índice de contaminación
fecal es Escherichia coli tipo Iya que su origen fecal es seguro.
Desde el punto de vista metodológico Escherichia coli es el Coliforme
ás es positivo a la prueba del Indol.
Los filtros de membrana son filtros
de superficie, que muestran una estructura microporosa precisa. Durante
la filtración las partículas mayores que los poros de la membrana son
retenidas de forma fiable en la superficie de la misma. Las particulas más
pequeñas pueden pasar el filtro.
B. Filtración a través de membrana
El número de coliformes totales presentes en el agua se determina mediante
la filtración de volúmenes específicos de la muestra a través
de filtros de membrana. Por lo general, están compuestos de ésteres
de celulosa, típicamente con poros de 0,45 mm de diámetro que retienen
los coliformes totales y otras clases de bacterias presentes en la muestra. Después
se incuban las membranas vueltas hacia arriba en un medio selectivo. En la práctica,
la técnica de filtración de membrana ofrece resultados comparables
a los que se obtienen con el método de tubos múltiples.
Una de las ventajas del método de filtración a través de membrana
es la prontitud con que pueden obtenerse los resultados y, en consecuencia, se pueden
llevar a cabo rápidamente acciones correctivas y operar en la planta de agua
de nuevo en forma normal. Esta técnica puede aplicarse en el análisis
de casi todos los tipos de agua, tambien se utiliza en el análisis de leche
y otros alimentos líquidos.
C. Aparatos y técnicas de filtración
El aparato de filtración consiste
de un disco incrustado (portafiltros) sostenido por soporte de goma o caucho y que
se ajusta a una base donde puede fijarse un embudo graduado o una rampa múltiple
de filtración.
El disco incrustado o perforado (portafiltros)
sostiene el filtro de membrana.
El portafiltros se coloca encima de
un soporte de filtración bien sea único o colector múltiple
(rampas de filtración para varias muestras a la vez) conectado a un sistema
de vacío.
D. Volumen de agua analizada
El volumen de muestra a filtrar es generalmente de 100 ml, excepto para aguas envasadas,
en las que se recomienda analizar muestras de 250 ml. Sin embargo, en aguas superficiales
y en general en aguas naturales sin tratar, el número de bacterias en 100
ml puede variar desde pocas decenas hasta cientos de millares. La siguiente tabla
proporciona unos datos que pueden servir de orientación:
Tipos de agua
Coliformes totales
Potable de consumo público
100 ml
Envasadas
250 ml
Manantiales
15; 60; 100 ml
Lagos, depósitos
4; 15; 60; 100 ml
Acometidas
0,08; 0,15; 0,5; 1,4 ml
De playas
0,08; 0,15; 0,5; 1,4 ml
De ríos
0,003; 0,01; 0,02; 0,08 ml
Residuales cloradas
0,003; 0,01; 0,02; 0,08 ml
Residuales sin tratar
0,0001; 0,0003; 0,001; 0,003; 0,01 ml
Las muestras comprendidas entre 30
ml y 250 ml se filtran directamente añadiendolas al embudo de filtración.
Para muestras entre 1 y 30 ml, se añaden primero al embudo 20-30 ml de solución
tamponada estéril y, encima de ella, se vierte la muestraa a filtrar.
Para todas las muestras inferiores a 1 ml, es preciso realizar previamente diluciones
con solución tamponada estéril.
Preparación de diluciones
Para realizar una dilución 1/10
(10-1), se pipetea asépticamente 1 ml de muestra en un tubo con
9 ml de solución tamponada estéril y se agita.
Muestra
1 ml
+
Diluyente
9 ml
=
Dilución
1/10 (10-1)
Para realizar una dilución 1/100
(10-2), se pipetea 1 ml de la dilución 1/10 en otro tubo con 9
ml de solución tamponada estéril y se agita.
Dilución
1/10 (10-1)
+
Diluyente
9 ml
=
Dilución
1/100 (10-2)
Así sucesivamente se van haciendo las diluciones que se necesiten, dependiendo
del grado de contaminación esperado de la muestra.
G. Medio de cultivo selectivo para Coliformes Totales: Caldo Endo, MF
Se utiliza el Caldo Endo para el
recuento de coliformes totales. Este es un medio para el aislamiento selectivo de
los coliformes totales pues lleva inhibidores para el resto de microorganismos. El
lauril sulfato y desoxicolato que forman parte de la fórmula del medio permite
crecer a los coliformes lactosa positivo pero inhibe el crecimiento del resto de
bacterias acompañantes. Las colonias lactosa positivo se colorean de rojo
por la liberación de fucsina del sulfato de fucsina. Las colonias de E.
coli y de los coliformes muestran generalmente un brillo metálico.
Se utiliza este medio para la identificación y recuento de coliformes en agua,
leche y otros líquidos mediante filtración sobre membrana y esta incluido
en las recomendaciones de la APHA "American Water Works Association and Water
Pollution Control Federation: Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater,
2004 ".
Medio sólido selectivo, que se prepara en placas para filtración de
membrana. Medio líquido selectivo, que se deposita en placas de cultivo que llevan
una almohadilla absorbente (aproximadamente 2 mL por placa)
Medio líquido selectivo Endo-MF
Se deposita en placas de cultivo que
llevan una almohadilla absorbente.
Aproximadamente se colocan 2 mL de medio
de cultivo por placa.
Composición:
Peptona de caseína 10,0 g,
Peptona de carne 10,0 g,
Extracto de levadura 1,5 g,
Lactosa 12,5 g,
Cloruro sódico 5,0 g,
Fosfato potásico 5,75 g,
Lauril sulfato sódico 0,05 g,
Desoxicolato sódico 0,10 g,
Sulfito sódico 2,10 g
Fuscina básica 1,05 g,
Agua destilada 1 L .
pH: 7,2 aproximadamente a 25 ºC
En la placa se coloca sobre el medio
de cultivo el filtro de membrana (una vez filtrada el agua).
H. Técnica de filtración sobre membrana
Desenvolver el filtro de la envoltura
con la que se ha esterilizado.
Separar el embudo de la base del filtro.
Colocar la membrana filtrante de 0,45
µm de tamaño de poro sobre el portafiltros de las base del mismo.
El manejo de las membranas se debe realizar con pinzas de punta plana o guantes de
goma para no lesionarlas.
Colocar el embudo sobre la base, teniendo
cuidado de no lesionar la membrana y que esta quede bien centrada. La membrana filtrante
queda ahora situado entre el embudo y la base-soporte del filtro.
Filtrar 100 mL de la muestra de agua
a través del filtro. Poner en marcha el sistema de vacio.
Una vez filtrada toda la muestra, parar
el sistema de vacio y separar el embudo de la base del filtro.
Retirar con pinzas estériles
o flameadas la membrana filtrante.
Colocar la membrana sobre la placa con
la almohadilla absorbente y el caldo Endo, de forma progresiva para evitar que queden
burbujas entre la membrana y el medio y que quede asegurado el contacto entre la
membrana y el medio.
Colocar la tapa de la placa de Petri,
invertir la placa e incubar en estufa a 37ºC durante 24 horas
En este medio todos los coliformes crecen
formando colonias de color rojo oscuro con el característico brillo metálico
de Escherichia coli de color verde-azulado aunque en los géneros Citrobacter,
Klebsiella y Enterobacter no es tan intenso como en Escherichia y puede
pasar desapercibido.
Los resultados se expresan en UFC/100 mL.
Expresión de los resultados
Cuando se obtienen recuentos de más
de 200 colonias sobre una misma membrana pueden dar resultados erróneos
debido a la superpoblación, ya que lo que aparece como una colonia puede ser
originado por varias bacterias bajo condiciones de hacinamiento. En estos casos debemos
volver a muestrear el agua y analizar muestras más diluidas.
Por otra parte, un número de colonias inferior a 10 ó 20 por
membrana es poco fiable como base para establecer cuantitativamente la concentración
bacteriana de la muestra. Por ejemplo, la obtención de 2 colonias a partir
del análisis de 1 ml de un agua, no nos permite afirmar que ese agua contenía
200 colonias en 100 ml. En estos caso conviene repetir el análisis filtrando
un volumen de muestra mayor.
Cuando el recuento de colonias está entre 20-200, los resultados se expresan:
Si hemos analizado una muestra sin diluir: Recuento de colonias = UFC / volumen
de muetra filtrada.
Si hemos analizado una muestra diluida: Recuento de colonias x Factor de dilución
= UFC/ volumen de muestra filtrada.
I. Entrenamiento en la interpretación de los resultados y los cálculos
Le aconsejamos (en el caso de no tener
experiencia previa en los cálculos y en la expresión de los resultados)
que se ejercite en la interpretación de estos ejemplos antes de contestar
a las preguntas del supuesto práctico, comprobando su correcta interpretación
haciendo clic en cada pregunta en la letra azul que antecede a la opción que
le parezca correcta.
En cada muestra se han filtrado diferentes cantidades de agua
Ejemplo #1 Agua de una fuente 100
mL filtrados
Fotografia de la placa
Hacer clic sobre la imagen para verla a más aumento
Pregunta
El resultado del análisis
de esta muestra es de :
a)
ausencia de UFC de coliformes totales en 100 mL de agua problema b)
2 UFC de coliformes totales por 100 mL de agua problema c)
20 UFC de coliformes totaless por 100 mL de agua problema d)
200 UFC de coliformes totales por 100 mL de agua problema e)
más de 100 colonias. Repetir la filtración con menor volumen de agua
Ejemplo #2 Agua embotellada 250 mL
filtrados
Fotografia de la placa
Hacer clic sobre la imagen para verla a más aumento
Pregunta
El resultado del análisis
de esta muestra es de :
a)
ausencia de UFC de coliformes totales en 100 mL de agua problema b)
ausencia de UFC de coliformes totales en 250 mL de agua problema c)
4 UFC de coliformes totales por 100 mL de agua problema, para cuantificar, repetir
el análisis filtrando un volumen mayor d)
4 UFC de coliformes totales por 250 mL de agua problema, para cuantificar, repetir
el análisis filtrando un volumen mayor e)
más de 100 colonias. Repetir la filtración con menor volumen de agua
Ejemplo #3 Agua embotellada 250 mL
filtrados
Fotografia de la placa
Hacer clic sobre la imagen para verla a más aumento
Pregunta
El resultado del análisis
de esta muestra es de :
a)
ausencia de UFC de coliformes totales en 1.000 mL de agua problema b)
ausencia de UFC de coliformes totales en 250 mL de agua problema c)
2 UFC de coliformes totales por 100 mL de agua problema d)
2 UFC de coliformes totales por 250 mL de agua problema e)
más de 100 colonias. Repetir la filtración con menor volumen de agua
Ejemplo #4 Agua de piscina 100 mL
filtrados
Fotografia de la placa
Hacer clic sobre la imagen para verla a más aumento
Pregunta
El resultado del análisis
de esta muestra es de :
a)
ausencia de UFC de coliformes totales en 100 mL de agua problema b)
ausencia de UFC de coliformes totales en 250 mL de agua problema c)
15 UFC de coliformes totales por 100 mL de agua problema d)
15 UFC de coliformes totales por 250 mL de agua problema e)
más de 100 colonias. Repetir la filtración con menor volumen de agua
J. Supuesto práctico
En tres muestras de agua, se han
filtrado diferentes cantidades de agua
En cada muestra, interprete la fotografia
de la placa y conteste a la pregunta, teniendo en cuenta el volumen de agua filtrado,
y el número y tipicidad de las colonias de las colonias
Muestra #1 Agua de una fuente 100
mL filtrados
Fotografia de la placa
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Pregunta
El resultado del análisis
de esta muestra es de :
a)
ausencia de UFC de coliformes totales en 100 mL de agua problema b)
12 UFC de coliformes totales por 100 mL de agua problema c)
120 UFC de coliformes totales por 100 mL de agua problema d)
1.200 UFC de coliformes totales por 100 mL de agua problema e)
más de 100 colonias. Repetir la filtración con menor volumen de agua
Muestra #2 Agua de balneario 10 mL
filtrados
Fotografia de la placa
Hacer clic sobre la imagen para verla a más aumento
Pregunta
El resultado del análisis
de esta muestra es de :
a)
ausencia de UFC de coliformes totales en 100 mL b)
29 UFC de coliformes totales por 100 mL c)
290 UFC de coliformes totales por 100 mL d)
2.900 UFC de coliformes totales por 100 mL e)
más de 100 colonias. Repetir la filtración con menor volumen de agua
Muestra #3 Agua residual 10 mL filtrados
Fotografia de la placa
Hacer clic sobre la imagen para verla a más aumento
Pregunta
El resultado del análisis
de esta muestra es de :
a)
ausencia de UFC de coliformes totales en 1.000 mL de agua problema b)
50 UFC de coliformes totales por 1.000 mL de agua problema c)
50 UFC de coliformes totales por 100 mL de agua problema d)
50 UFC de coliformes totales por 10 mL de agua problema e)
más de 100 colonias. Repetir la filtración con menor volumen de agua
Muestra #4 Agua embotellada 250 mL
filtrados
Fotografia de la placa
Hacer clic sobre la imagen para verla a más aumento
Pregunta
El resultado del análisis
de esta muestra es de :
a)
ausencia de UFC de coliformes totales en 1.000 mL de agua problema b)
ausencia de UFC de coliformes totales en 250 mL de agua problema c)
20 UFC de coliformes totales por 1.000 mL de agua problema d)
20 UFC de coliformes totales por 250 mL de agua problema e)
más de 100 colonias. Repetir la filtración con menor volumen de agua
Puede acceder a más demostraciones de ejercicios interactivos, en la siguiente dirección web:
