Recuento de
Coliformes Totales

Filtración a través de membrana

Puede acceder a más información sobre este curso, en la siguiente dirección web:

http://fundacion.usal.es/microaguas

Los coliformes totales son las Enterobacteriaceae lactosa-positivas y constituyen un grupo de bacterias que se definen más por las pruebas usadas para su aislamiento que por criterios taxonómicos. Pertenecen a la familia Enterobacteriaceae y se caracterizan por su capacidad para fermentar la lactosa con producción de ácido y gas, más o menos rápidamente, en un periodo de 48 horas y con una temperatura de incubación comprendida entre 30-37ºC.

Son bacilos gramnegativos, aerobios y anaerobios facultativos, no esporulados. Del grupo <<coliforme>> forman parte varios géneros: Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, etc. Se encuentran en el intestino del hombre y de los animales, pero también en otros ambientes: agua, suelo, plantas, cáscara de huevo, etc.
Una elevada proporción de los coliformes que existen el los sistemas de distribución no se debe a un fallo en el tratamiento en la planta, sino a un recrecimiento de las bacterias en las conducciones. Dado que es dificil distinguir entre recrecimiento de coliformes y nuevas contaminaciones, se admite que todas las apariciones de coliformes son nuevas contaminaciones, mientras no se demuestre lo contrario.

Dentro del grupo de los coliformes totales existe un subgrupo que es el de los Coliformes fecales. Los coliformes fecales son coliformes totales que además fermentan la lactosa con producción de ácido y gas en 24-48 horas a temperaturas comprendidas entre 44 y 45ºC en presencia de sales biliares. Los coliformes fecales comprenden principalmente Escherichia coli y algunas cepas de Enterobacter y Klebsiella.

Su origen es principalmente fecal y por esos se consideran índices de contaminación fecal. Pero el verdadero índice de contaminación fecal es Escherichia coli tipo I ya que su origen fecal es seguro. Desde el punto de vista metodológico Escherichia coli es el Coliforme ás es positivo a la prueba del Indol.

Apartados de este ejercicio

A. Filtros de membrana
B. Filtración a través de membrana
C. Aparatos y técnicas de filtración
D. Volumen del agua a ser analizada
E. Toma de muestra
F. Material y equipo
G. Medio de cultivo: Caldo Endo
H. Técnica
I. Entrenamiento en la interpretación de los resultados y los cálculos
J. Supuesto práctico
K. Envío al servidor de los resultados del ejercicio


A. Filtros de membrana

Los filtros de membrana son filtros de superficie, que muestran una estructura microporosa precisa. Durante la filtración las partículas mayores que los poros de la membrana son retenidas de forma fiable en la superficie de la misma. Las particulas más pequeñas pueden pasar el filtro.

filtros de membrana




B. Filtración a través de membrana

El número de coliformes totales presentes en el agua se determina mediante la filtración de volúmenes específicos de la muestra a través de filtros de membrana. Por lo general, están compuestos de ésteres de celulosa, típicamente con poros de 0,45 mm de diámetro que retienen los coliformes totales y otras clases de bacterias presentes en la muestra. Después se incuban las membranas vueltas hacia arriba en un medio selectivo. En la práctica, la técnica de filtración de membrana ofrece resultados comparables a los que se obtienen con el método de tubos múltiples.

Una de las ventajas del método de filtración a través de membrana es la prontitud con que pueden obtenerse los resultados y, en consecuencia, se pueden llevar a cabo rápidamente acciones correctivas y operar en la planta de agua de nuevo en forma normal. Esta técnica puede aplicarse en el análisis de casi todos los tipos de agua, tambien se utiliza en el análisis de leche y otros alimentos líquidos.



C. Aparatos y técnicas de filtración

El aparato de filtración consiste de un disco incrustado (portafiltros) sostenido por soporte de goma o caucho y que se ajusta a una base donde puede fijarse un embudo graduado o una rampa múltiple de filtración.

rampa de filtracion

El disco incrustado o perforado (portafiltros) sostiene el filtro de membrana.

portafiltros

El portafiltros se coloca encima de un soporte de filtración bien sea único o colector múltiple (rampas de filtración para varias muestras a la vez) conectado a un sistema de vacío.

filtro



D. Volumen de agua analizada

El volumen de muestra a filtrar es generalmente de 100 ml, excepto para aguas envasadas, en las que se recomienda analizar muestras de 250 ml. Sin embargo, en aguas superficiales y en general en aguas naturales sin tratar, el número de bacterias en 100 ml puede variar desde pocas decenas hasta cientos de millares. La siguiente tabla proporciona unos datos que pueden servir de orientación:

Tipos de agua Coliformes totales
Potable de consumo público 100 ml
Envasadas 250 ml
Manantiales 15; 60; 100 ml
Lagos, depósitos 4; 15; 60; 100 ml
Acometidas 0,08; 0,15; 0,5; 1,4 ml
De playas 0,08; 0,15; 0,5; 1,4 ml
De ríos 0,003; 0,01; 0,02; 0,08 ml
Residuales cloradas 0,003; 0,01; 0,02; 0,08 ml
Residuales sin tratar 0,0001; 0,0003; 0,001; 0,003; 0,01 ml

Las muestras comprendidas entre 30 ml y 250 ml se filtran directamente añadiendolas al embudo de filtración.
Para muestras entre 1 y 30 ml, se añaden primero al embudo 20-30 ml de solución tamponada estéril y, encima de ella, se vierte la muestraa a filtrar.
Para todas las muestras inferiores a 1 ml, es preciso realizar previamente diluciones con solución tamponada estéril.

Preparación de diluciones

Para realizar una dilución 1/10 (10-1), se pipetea asépticamente 1 ml de muestra en un tubo con 9 ml de solución tamponada estéril y se agita.

Muestra
1 ml

+

Diluyente
9 ml

=

Dilución
1/10 (10-1)

Para realizar una dilución 1/100 (10-2), se pipetea 1 ml de la dilución 1/10 en otro tubo con 9 ml de solución tamponada estéril y se agita.

Dilución
1/10 (10-1)

+

Diluyente
9 ml

=

Dilución
1/100 (10-2)


Así sucesivamente se van haciendo las diluciones que se necesiten, dependiendo del grado de contaminación esperado de la muestra.



E. Toma de muestra

La técnica de muestreo depende del lugar donde se realiza dicho muestreo, para conocer los detalles sobre la toma de muestras de aguas para análisisi microbiológicos haga clic sobre esta frase.



F. Material y equipo


G. Medio de cultivo selectivo para Coliformes Totales: Caldo Endo, MF

Se utiliza el Caldo Endo para el recuento de coliformes totales. Este es un medio para el aislamiento selectivo de los coliformes totales pues lleva inhibidores para el resto de microorganismos. El lauril sulfato y desoxicolato que forman parte de la fórmula del medio permite crecer a los coliformes lactosa positivo pero inhibe el crecimiento del resto de bacterias acompañantes. Las colonias lactosa positivo se colorean de rojo por la liberación de fucsina del sulfato de fucsina. Las colonias de E. coli y de los coliformes muestran generalmente un brillo metálico.

Se utiliza este medio para la identificación y recuento de coliformes en agua, leche y otros líquidos mediante filtración sobre membrana y esta incluido en las recomendaciones de la APHA "American Water Works Association and Water Pollution Control Federation: Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 2004 ".

Medio sólido selectivo, que se prepara en placas para filtración de membrana.

Medio líquido selectivo, que se deposita en placas de cultivo que llevan una almohadilla absorbente (aproximadamente 2 mL por placa)

Medio líquido selectivo Endo-MF

Se deposita en placas de cultivo que llevan una almohadilla absorbente.

Endo-MF

Aproximadamente se colocan 2 mL de medio de cultivo por placa.

Endo-MF

Composición:

Peptona de caseína 10,0 g,
Peptona de carne 10,0 g,
Extracto de levadura 1,5 g,
Lactosa 12,5 g,
Cloruro sódico 5,0 g,
Fosfato potásico 5,75 g,
Lauril sulfato sódico 0,05 g,
Desoxicolato sódico 0,10 g,
Sulfito sódico 2,10 g
Fuscina básica 1,05 g,
Agua destilada 1 L .


pH: 7,2 aproximadamente a 25 ºC

En la placa se coloca sobre el medio de cultivo el filtro de membrana (una vez filtrada el agua).


H. Técnica de filtración sobre membrana

Desenvolver el filtro de la envoltura con la que se ha esterilizado.

filtro estéril

Separar el embudo de la base del filtro.

filtro

Colocar la membrana filtrante de 0,45 µm de tamaño de poro sobre el portafiltros de las base del mismo.

El manejo de las membranas se debe realizar con pinzas de punta plana o guantes de goma para no lesionarlas.

membrana filtrante

Colocar el embudo sobre la base, teniendo cuidado de no lesionar la membrana y que esta quede bien centrada. La membrana filtrante queda ahora situado entre el embudo y la base-soporte del filtro.

Filtrar 100 mL de la muestra de agua a través del filtro. Poner en marcha el sistema de vacio.

Una vez filtrada toda la muestra, parar el sistema de vacio y separar el embudo de la base del filtro.

Retirar con pinzas estériles o flameadas la membrana filtrante.

Colocar la membrana sobre la placa con la almohadilla absorbente y el caldo Endo, de forma progresiva para evitar que queden burbujas entre la membrana y el medio y que quede asegurado el contacto entre la membrana y el medio.

caldo Endo

Colocar la tapa de la placa de Petri, invertir la placa e incubar en estufa a 37ºC durante 24 horas

En este medio todos los coliformes crecen formando colonias de color rojo oscuro con el característico brillo metálico de Escherichia coli de color verde-azulado aunque en los géneros Citrobacter, Klebsiella y Enterobacter no es tan intenso como en Escherichia y puede pasar desapercibido.

Los resultados se expresan en UFC/100 mL.

coliformes

Expresión de los resultados
Cuando se obtienen recuentos de más de 200 colonias sobre una misma membrana pueden dar resultados erróneos debido a la superpoblación, ya que lo que aparece como una colonia puede ser originado por varias bacterias bajo condiciones de hacinamiento. En estos casos debemos volver a muestrear el agua y analizar muestras más diluidas.

Por otra parte, un número de colonias inferior a 10 ó 20 por membrana es poco fiable como base para establecer cuantitativamente la concentración bacteriana de la muestra. Por ejemplo, la obtención de 2 colonias a partir del análisis de 1 ml de un agua, no nos permite afirmar que ese agua contenía 200 colonias en 100 ml. En estos caso conviene repetir el análisis filtrando un volumen de muestra mayor.

Cuando el recuento de colonias está entre 20-200, los resultados se expresan:
Si hemos analizado una muestra sin diluir: Recuento de colonias = UFC / volumen de muetra filtrada.
Si hemos analizado una muestra diluida: Recuento de colonias x Factor de dilución = UFC/ volumen de muestra filtrada.


I. Entrenamiento en la interpretación de los resultados y los cálculos

Le aconsejamos (en el caso de no tener experiencia previa en los cálculos y en la expresión de los resultados) que se ejercite en la interpretación de estos ejemplos antes de contestar a las preguntas del supuesto práctico, comprobando su correcta interpretación haciendo clic en cada pregunta en la letra azul que antecede a la opción que le parezca correcta.

En cada muestra se han filtrado diferentes cantidades de agua
Ejemplo #1 Agua de una fuente 100 mL filtrados
Fotografia de la placa



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coliformes totales por 100 mL

Pregunta

El resultado del análisis de esta muestra es de :

a) ausencia de UFC de coliformes totales en 100 mL de agua problema
b) 2 UFC de coliformes totales por 100 mL de agua problema
c) 20 UFC de coliformes totaless por 100 mL de agua problema
d) 200 UFC de coliformes totales por 100 mL de agua problema
e) más de 100 colonias. Repetir la filtración con menor volumen de agua

Ejemplo #2 Agua embotellada 250 mL filtrados
Fotografia de la placa



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coliformes totales

Pregunta

El resultado del análisis de esta muestra es de :

a) ausencia de UFC de coliformes totales en 100 mL de agua problema
b) ausencia de UFC de coliformes totales en 250 mL de agua problema
c) 4 UFC de coliformes totales por 100 mL de agua problema, para cuantificar, repetir el análisis filtrando un volumen mayor
d) 4 UFC de coliformes totales por 250 mL de agua problema, para cuantificar, repetir el análisis filtrando un volumen mayor
e) más de 100 colonias. Repetir la filtración con menor volumen de agua

Ejemplo #3 Agua embotellada 250 mL filtrados
Fotografia de la placa



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ausencia de UFC de coliformes totales

Pregunta

El resultado del análisis de esta muestra es de :

a) ausencia de UFC de coliformes totales en 1.000 mL de agua problema
b) ausencia de UFC de coliformes totales en 250 mL de agua problema
c) 2 UFC de coliformes totales por 100 mL de agua problema
d) 2 UFC de coliformes totales por 250 mL de agua problema
e) más de 100 colonias. Repetir la filtración con menor volumen de agua

Ejemplo #4 Agua de piscina 100 mL filtrados
Fotografia de la placa



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UFC de coliformes

Pregunta

El resultado del análisis de esta muestra es de :

a) ausencia de UFC de coliformes totales en 100 mL de agua problema
b) ausencia de UFC de coliformes totales en 250 mL de agua problema
c) 15 UFC de coliformes totales por 100 mL de agua problema
d) 15 UFC de coliformes totales por 250 mL de agua problema
e) más de 100 colonias. Repetir la filtración con menor volumen de agua



J. Supuesto práctico

En tres muestras de agua, se han filtrado diferentes cantidades de agua

En cada muestra, interprete la fotografia de la placa y conteste a la pregunta, teniendo en cuenta el volumen de agua filtrado, y el número y tipicidad de las colonias de las colonias

Muestra #1 Agua de una fuente 100 mL filtrados
Fotografia de la placa



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coliformes totales

Pregunta

El resultado del análisis de esta muestra es de :

a) ausencia de UFC de coliformes totales en 100 mL de agua problema
b) 12 UFC de coliformes totales por 100 mL de agua problema
c) 120 UFC de coliformes totales por 100 mL de agua problema
d) 1.200 UFC de coliformes totales por 100 mL de agua problema
e) más de 100 colonias. Repetir la filtración con menor volumen de agua

Muestra #2 Agua de balneario 10 mL filtrados
Fotografia de la placa



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Agua de balneario

Pregunta

El resultado del análisis de esta muestra es de :

a) ausencia de UFC de coliformes totales en 100 mL
b) 29 UFC de coliformes totales por 100 mL
c) 290 UFC de coliformes totales por 100 mL
d) 2.900 UFC de coliformes totales por 100 mL
e) más de 100 colonias. Repetir la filtración con menor volumen de agua

Muestra #3 Agua residual 10 mL filtrados
Fotografia de la placa



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Agua residual

Pregunta

El resultado del análisis de esta muestra es de :

a) ausencia de UFC de coliformes totales en 1.000 mL de agua problema
b) 50 UFC de coliformes totales por 1.000 mL de agua problema
c) 50 UFC de coliformes totales por 100 mL de agua problema
d) 50 UFC de coliformes totales por 10 mL de agua problema
e) más de 100 colonias. Repetir la filtración con menor volumen de agua

Muestra #4 Agua embotellada 250 mL filtrados
Fotografia de la placa



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Agua embotellada

Pregunta

El resultado del análisis de esta muestra es de :

a) ausencia de UFC de coliformes totales en 1.000 mL de agua problema
b) ausencia de UFC de coliformes totales en 250 mL de agua problema
c) 20 UFC de coliformes totales por 1.000 mL de agua problema
d) 20 UFC de coliformes totales por 250 mL de agua problema
e) más de 100 colonias. Repetir la filtración con menor volumen de agua

Puede acceder a más demostraciones de ejercicios interactivos, en la siguiente dirección web:

http://seguridadycalidadalimentaria.usal.es/


© Laboratorio de Tecnología Educativa. Departamento de Microbiología y Genética. Universidad de Salamanca.